3.2.3 抗体检测与监测
酶联免疫吸附实验(elisa)是检测或/和监测app抗体的最常用方法且已成功商品化
在临床上,应注意最急性型及急性型传染性胸膜肺炎与败血型巴氏菌、败血型链球菌、败血型沙门氏菌及急性猪丹毒、高致病性蓝耳病、弓型体、猪瘟进行鉴别诊断
本病的特征性病变主要在于胸腔,其它部位可见相关病灶最急性病例,鼻腔流出血色鼻液,气管与支气管內充满泡沫样血色黏液(图1),镜下可见肺组织局部出血,有水肿液聚集,支气管周围及肺泡腔內均有大量嗜中性粒细胞侵润(图2),脏充血、出血,应注意与猪瘟、猪丹毒及猪链球菌肺炎间的鉴别诊断
虽可利用pcr方法直接从组织样品(如:扁桃体拭子)中检测apx毒素,但apx毒素也可能存在于猪放线杆隐源性机化性肺炎菌中,故apx毒素基因检测阳性时,最好对细菌进行纯培养,以确认病原菌种类但对app进行纯培养并不容易,特别是利用扁桃体拭子时,因扁桃体上有很多共生菌,而共生菌的生长速度常快于胸膜肺炎放线杆菌,而影响到分离培养结果故分离不到胸膜肺炎放线杆菌也不能说明猪群呈app阴性
app的毒力基因apx iv具有种特异性,目前所开发的多种pcr方法均以检测apx iv为基础,检测对象常为细菌纯养物直接用pcr检测新鲜肺中是否存在胸膜肺炎放线杆菌的方法已建立并商业化(adiavet? app 检测试剂盒),还建立了套氏pcr方法(灵敏度可高达10个细菌)对经过甲醛固定处理并包埋在石蜡中的肺组织样品进行app检测[5],还可用实机化性肺炎ct时定量pcr直接扁桃体中病原菌(灵敏度:5个细菌)[6],但这种直接检测病料中病原菌的方法尚未普遍推广[7]
3. 常用诊断方法
急性病例时,肺部出现梅绀色且界限清晰的出血灶、坏死灶(图3),胸腔积液,有纤维素性渗出物(图4) 镜下可见肺脏病灶区的血管扩张并聚集大量红细胞,有些血管的管腔內有血栓样物质伴随严重出血病变,周围的肺泡壁变厚呈现玻璃膜样病变肺间质与肺泡腔可见广泛的纤维素及水肿液聚集
目前研究显示,胸膜肺炎放线杆菌的致病因子包括:脂多糖(lps)、apx毒素、荚膜多糖、菌毛、外膜蛋白等,其中apx毒素为目前研究最详尽并已知具有杀灭细胞、溶解红细胞的重要毒力因子sebunya等(1983)认为:胸膜肺炎放线杆菌具有荚膜而不易被吞噬,婴儿吸入性肺炎使本菌能在肺脏內存活及增殖;此外,细菌死亡后內毒素释出,会对血管內皮细胞造成伤害,而引致血管內纤维素性血栓及肺小叶水肿,导致呼吸困难、休克,同时本菌所分泌的外毒素——apx毒素可抑制肺脏吞噬细胞的作用,帮助本菌深入肺部apx毒素共有四大类型,其中apx i对肺脏巨噬细胞与淋巴细胞具有杀灭作用
虽然实验室诊断尚存在一定的不足,但其是临床诊断与剖检诊断的有力补充,特别是在对猪群进行app流行病学调查时,有着独特优势,故应综合临床症状、病理剖检、细菌分离与检测及血清学监测等方法
因各种实验室检测方法均存在优势与不足,故在解读app实验室检测结果时,需格外谨慎目前行业内所建立的多种app检测方法多以apx宝宝吸入性肺炎 iv毒素或其抗体为基础(血清学或pcr),但当猪群感染无毒力或低毒力的app菌株时,无临床症状且对猪群影响较小,但会影响检测结果的解读,故当apx iv呈阳性时,仍需对细菌毒力、血清型及对疫病的影响进行深入探究目前所建立的血清学或pcr分型方法均不完善,仅能对部分血清型进行鉴别或区分,易出现假阴性
养猪巴巴网网友了解到目前已建立细菌分离、病原菌检测、抗体监测等多种胸膜肺炎放线杆菌实验室诊断方法但胸膜肺炎放线杆菌的血清型较多、各血清型间毒力差异大,故在实验室诊断时应充分考虑血清型与毒力对于疾病发生、发展过程的影响
该病多发于春秋交替、气候多变的季节(我国大部分地区为10月～4月间),生长育肥猪多发因易感猪群年龄原性机化性肺炎治疗、群体免疫力、病原感染压力不同,可表现为最急性型、急性型与慢性型最急性型病例,患猪体温突然升高(41～42℃),呼吸困难,精神沉郁,鼻子、耳朵、四肢等末梢部位甚至全身发绀,有时鼻腔有血色泡沫急性型患猪体温升高(40～41℃),厌食,饮水减少,呼吸困难,咳嗽若治疗及时可转变成慢性型慢性型患猪常无明显临床症状,体温常不升高,间歇性咳嗽,食欲不佳,生长缓慢,饲料转换率差,影响猪群经济效益,此外慢性型患猪还是猪群app的潜在感染源
macinnes等(1988)指出:猪是胸膜肺炎放线杆菌自然状况下唯一易感动物,受感染而耐过急性期的猪常呈慢性病变——肺溃疡及肋膜粘连不易剥离本病主要通过空气传播,慢性感染的猪只常扮演病原携带者角色,本病菌常存性肺炎婴儿护理在于鼻腔与扁桃腺,这是本菌污染场不易清除的主因本病的发生常和饲养密度大、空气流通不良、气候突然剧烈改变等环境应激及其它生物性病原感染引发免疫抑制相关
3.2.4 实验室诊断结果解读
1.流行病学及致病机理
2.临床症状
为了判断胸膜肺炎放线杆菌在疫病发生过程中的作用,在本病诊断与监测过程中,应选择适宜方法对该菌的血清型与毒力进行检测目前主要的血清分型方法包括补体结合实验、间接血凝实验、elisa等,同时也发展出多种pcr分型技术,通过检测细菌纯培养物的apxi、apxii 与 apxiii等毒力基因(表1)来确定病原菌的血清型与潜在毒力如赵耘等人建立了多重pcr方法可对1～8型的app进行血清型分型[3];l. zhou等小儿吸入性肺炎人建立了多重pcr方法对具有免疫交叉反应的血清型(3、6与8)进行了鉴别诊断[4]
传染性胸膜肺炎的常用诊断方法包括临床诊断、病理诊断、细菌分离、pcr检测、血清学检测及屠宰场病变评估分析等各种检测方法均有其优势及不足之处,常需相互补充,简述如下
目前已知胸膜肺炎放线杆菌至少有2种生物型与15种血清型,不同血清型之间及同一血清型不同菌株之间的毒力均存在差异,从而导致该病的诊断非常困难[2]
3.2.1 血清型的多样性与毒力差异
屠宰场肺部病变评分法是生长育肥猪慢性肺炎的一种重要的回顾性诊断方法,已被广泛应用于胸膜炎(包括传染性胸膜肺炎)的感染状况调查vincent等人[10]发展出屠宰场胸膜炎评估系统(slaughterhouse pl机化性肺炎进展eurisy evaluation system [ seps ])该法依据胸膜炎粘连是否存在,存在的位置、范围及严重程度对其评分,分为0～4个等级(表2)
3.3 屠宰场病变评估
慢性病例,肺脏有局灶性的坏死或溃疡(图5),镜下肺病变区呈现液化坏死灶,而坏死周围伴随有细胞质泡沫样,细胞核偏于细胞角落的变性单核细胞围绕,这些细胞常呈漩涡样排列(图6) 因纤维素性渗出,导致肋膜炎、心包炎,肺脏与肋骨间常发生粘连不易剖离(图7)慢性病例应注意与巴氏杆菌、放线杆菌、链球菌等引发化脓性肺炎或肺溃疡感染进行鉴别诊断
3.2 实验室诊断
3.1 病理诊断
3.2.2 病原菌检测
细菌分离与pcr检测是目前最常用的胸膜肺炎放线杆菌病原检测方法胸膜肺炎放线杆菌培养条件尖质性肺炎较苛刻,时间投入大,分离部位(扁桃体、气管或肺等)常有杂菌污染,导致分离失败可用5%的羊血琼脂培养基从肺部、扁桃体及气管内分离病原菌,该菌与表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌共培养时可出现完全溶血现象也可用病变肺组织作抹片直接进行显微镜检查(革兰氏阴性杆菌)从慢性胸膜肺炎的患猪或已用药物治疗的肺组织中分离培养胸膜肺炎放线杆菌难度更大,故依靠细菌分离确诊慢性型app的难度较高因胸膜肺炎放线杆菌的分离培养,特别是从慢性型或亚临床型病例中的分离率较低,故血清型方法对于本病的诊断与监测尤为重要[8]app抗体检测的主要方法包括:溶血素中和试验(hnt)、酶联免疫吸附试验(elisa)及补体结合试验等补体结合试验因特异性差、操作繁性肺炎后期护理琐等原因现已很少使用[9]elisa因特异性与敏感性均较好,已成为最常用的app抗体检测与监测手段,目前已有多个商品化elisa试剂盒,如idexx公司的apx iv抗体检测试剂盒、biovet 公司的细菌分型elisa试剂盒等,但两者所检测抗体标的物不同,idexx公司的试剂盒检测的是apx iv抗体,因apx iv毒素仅在体内感染时才能表达,在细菌体外培养时不能分泌该毒素,故检测apx iv毒素抗体的试剂盒可用于区分自然感染与疫苗免疫,对猪群的感染状态进行判断,但无法确定细菌的血清型与毒力而biovet等公司的试剂盒检测荚膜脂多糖抗体,可对app的某些血清型与细菌毒力进行鉴别诊断,但无法区分机化性肺炎病因病理自然感染与疫苗免疫且易出现假阴性
传染性胸膜肺炎(actinobacillus pleuropneumoniae ,app)是由胸膜肺炎放线杆菌感染所致的一种纤维素性、出血性、坏死性肺炎shope最早于1964提出本病相关的报告之后,本病例一直广布于全世界,对全球养猪业造成了巨大经济损失[1]是猪只重要呼吸道疾病,所有年龄阶段均可感染,但以肥育猪较常见美国很多猪群已基本净化了本病,但app目前在我国比较普遍(几乎无阴性场),临床症状与其它呼吸道疾病相似,在临床上易造成误诊,故笔者将自己对app的诊断与防控措施的体会作如下总结,以期与同行分享
影响胸膜肺炎放线杆菌毒力的因素很多,但是否存在毒力基因.apxi、apxi源性机化性肺炎医院i与apxiii是影响该菌毒力的重要因素这三种毒力基因能够产生毒素,阻断中性粒细胞与巨噬细胞的吞噬功能,从而影响猪只免疫防御功能而毒力因子apx iv广泛存在于各种血清型的胸膜肺炎放线杆菌内,且具有良好的种特异性,近年来所发展多种app诊断方法(pcr或elisa)均以检测apx毒力基因及其抗体为基础
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